生命科学与医药学院陈贵钱课题组揭示Nf2作为PTH1R偏向性内化开关调控骨稳态的新机制

骨骼稳态的精准调控是医学领域的核心前沿，也是骨质疏松等骨骼疾病靶向药物研发的关键基础。甲状旁腺激素（PTH）及甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）通过其1型受体（PTH1R）主导骨骼发育和骨代谢。PTH1R已成为骨质疏松治疗的明星靶点，已上市的PTH1R激动剂（特立帕肽、阿巴洛帕肽）及新一代偏向性药物成为临床与研发热点。然而，PTH1R信号在细胞内的精细时空调控机制尚不明确，这一核心科学问题严重制约了更安全、高效的抗骨质疏松药物开发。

近日，陈贵钱课题组在该领域取得重要突破，以直接投稿方式（Direct Submission）在国际顶级学术期刊《美国国家科学院院刊》（PNAS，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，近五年影响因子10.6）发表题为“Nf2 orchestratesβ-arrestin2-biased PTH1R signaling tocouplewith bone mass with skeletal integrity”的研究成果，该研究首次发现Nf2作为PTH1R受体的“偏向性内化开关”，为理解骨骼稳态维持机制提供了全新视角，并为骨质疏松治疗提供了新靶点。浙江理工大学为第一署名单位，研究生廖军光为本文第一作者，陈贵钱为本文最后通讯作者。

本研究发现，Nf2是PTH1R转运与信号转导的关键内源性调控因子。在软骨细胞中条件性敲除Nf2导致短肢型侏儒、生长板结构紊乱、软骨细胞增殖与肥大分化受阻，并出现骨小梁过度增生而骨皮质变薄的表型。机制上，Nf2直接结合PTH1R胞质C端（第464–591位氨基酸），不依赖GRK介导的受体磷酸化，通过偏向性招募β-arrestin2促进PTH1R选择性内化。Nf2缺失使PTH1R内吞解偶联，导致cAMP-CREB-pSOX9（S181）及VEGF信号轴持续放大，其骨表型与PTH1R偏向性激动剂阿巴洛帕肽诱导的改变高度相似。本研究首次确立Nf2作为软骨细胞中PTH1R的“偏向性内化开关”，揭示了一种不依赖GRK磷酸化的新型β-arrestin2招募机制，这一发现革新了GPCR信号偏向性调控的传统经典范式，为骨骼细胞解码信号强度与持续时间提供了全新的分子框架。

Nf2在 Col2a1 阳性细胞中的缺失导致短肢型侏儒症

软骨内骨化是高度精细调控的生物学过程，其紊乱可直接导致短肢型侏儒症等严重骨骼发育异常。本研究发现，Nf2 在生长板的前肥大区与肥大区中高表达，提示其在软骨细胞分化中发挥关键作用。为解析其分子功能，我们构建了软骨谱系（Col2a1⁺细胞）特异性敲除 Nf2 的小鼠模型（Nf2cKO）。结果发现，Nf2缺失导致小鼠体型和体重显著减小，出现短枝型侏儒症表型。

组织学分析显示：从胚胎期 E14.5 起，Nf2 缺失导致软骨细胞肥大受损；E16.5 后肥大区缩短，增殖区持续增殖下降直至出生后。出生后P5 时生长板各分区均显著缩短且比例失调，P14 时肥大区进一步缩短，次级骨化中心面积显著减小，增殖软骨细胞比例大幅下降。这表明 Nf2 是软骨内骨化的关键调控因子，其缺失导致增殖-分化级联失控，引发短肢型侏儒症。

Nf2缺失导致软骨细胞 PTH1R 信号异常激活

为探究Nf2缺失对生长板的影响，本研究对Nf2缺失小鼠进行了系统分析。结果显示，Nf2缺失软骨中II型胶原轻度降低，而SOX9、Runx2及X型胶原蛋白水平无显著变化，但免疫组化证实ColX分布与强度下降，与肥大区缩短一致。值得注意的是，SOX9第181位丝氨酸磷酸化（p-SOX9 S181）显著增加，并特异性富集于前肥大区和肥大区。鉴于p-SOX9 S181是PTH1R信号的直接下游分子，提示Nf2缺失导致PTH1R过度激活。同时，我们发现p-CREB也显著升高，PTH1R下游因子Vegf-A在Nf2敲除的组织中上调明显。以上数据表明，Nf2缺失导致PTH1R–pCREB–pSOX9–Vegf-A信号轴持续过度激活，确立了Nf2作为软骨细胞内源性负调控因子，限制PTH1R信号输出。

我们此前的研究发现，Nf2缺失导致成骨细胞中FAK活性显著下降（Junguang Liao et.al, Nature Communications， 2025）。本研究中，Nf2缺失的软骨细胞同样出现FAK活性降低，但其变化幅度明显小于成骨细胞。此外，PTH1R与FAK并无直接结合。可见，在软骨细胞中，FAK通路并非影响PTH1R信号的主要途径。

Nf2 结合 PTH1R 的 C 端结构域，不依赖经典IHH-PTHrP 反馈环抑制其信号

基于Nf2缺失导致的PTH1R信号过度激活，我们探究其发生的可能分子机制。在Nf2缺失的软骨细胞中，经典的Ihh-PTHrP负反馈通路并未发生改变，提示Nf2可能直接影响PTH1R胞内信号转导，而非介导配体或受体表达。免疫共沉淀与截断突变体实验证实，Nf2与PTH1R在软骨细胞中存在相互作用，其结合区域定位于PTH1R的C端胞质尾区（第464–591位氨基酸），并证实Nf2和PTH1R在前肥大区与肥大区软骨细胞中共定位。

功能上，Nf2缺失导致软骨细胞对PTH1R激动剂阿巴洛帕肽（ABL）高度敏感：低至 1–5 nM 的ABL即可诱发 CREB 磷酸化增强，且ABL诱导的cAMP产生在ATDC5细胞和原代软骨细胞中分别升高 26.88% 和 36.10%，而过表达Nf2则可抑制cAMP积累达19.98%；使用佛司可林直接激活cAMP-PKA通路，同样观察到Nf2缺陷细胞中p-CREB与p-SOX9反应增强，过表达细胞中反应减弱。

值得注意的是，Nf2并不与PTH1R的经典效应分子Gαs、β-arrestin1或β-arrestin2结合，表明Nf2缺失导致的cAMP过度产生、CREB磷酸化及SOX9激活，并非通过干扰这些经典效应分子的招募实现，而是独立于经典Ihh-PTHrP反馈环的全新机制。

Nf2 控制 PTH1R 内吞的非经典分支：绕过 GRK，强制实现 β-arrestin2 依赖性内化

为解析 Nf2 调控 PTH1R 信号输出的机制，我们通过慢病毒介导的Nf2敲低实验发现，Nf2选择性调控PTH1R与βarrestin2的结合，而不影响其与Gαs的相互作用；Nf2缺失后，PTH1R–βarrestin2复合物形成显著受损，而PTH1R–Gαs结合保持不变。由于PTH1R–βarrestin2复合物是受体内化的关键启动步骤，我们进一步利用膜蛋白生物素化及活细胞超分辨成像（HISSIM）证实，Nf2敲低导致激动剂刺激后PTH1R大量滞留于质膜，胞质内化囊泡明显减少，内吞动力学显著减弱。尤为重要的是，Nf2缺失并不改变GRK2介导的PTH1R磷酸化水平，从而排除了经典磷酸化依赖性脱敏途径的参与。这一发现颠覆了“βarrestin招募必然由GRK磷酸化启动”的传统范式，为理解GPCR信号转导提供了“支架导向型调控”的新维度。

综上，本研究发现Nf2是PTH/PTHrP信号通路的关键负调控因子。Nf2通过特异性促进βarrestin2偶联的PTH1R内化，实现与经典G蛋白信号的解偶联，从而精确协调骨代谢稳态与骨骼结构完整性。该工作确立了Nf2作为软骨细胞内源性PTH1R转运调控分子的核心地位，揭示了骨形成与骨质量解偶联的新机制。更重要的是，靶向Nf2介导的βarrestin2招募策略，有望在保留骨合成代谢效应的同时规避高钙血症，为开发更安全的抗骨质疏松药物提供了全新设计思路。目前相关治疗专利已提交申请，本研究得到了国家自然科学基金面上项目资助。

【最后通讯作者简介】

陈贵钱，浙江大学理学博士、美国阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）联培博士，美国康奈尔大学威尔医学院（Weill Cornell Medicine）和佐治亚大学（UGA）博士后。2018年11月加入浙江理工大学，2022年至2023年底科技外派至浙江省经济和信息化厅（生物医药处）。聚焦骨系干细胞与骨生物学研究，主持国家自然科学基金面上项目、浙江省自然科学基金重点项目等多项课题。以通讯作者/第一作者在PNAS、Nature Communications、Signal Transduction and Targeted Therapy、Cell Reports、Bone Research、JCI Insight等国际权威期刊发表SCI论文30余篇，累计他引5600余次（谷歌学术数据），含高被引论文2篇。曾获全国生命科学微课教学比赛二等奖（全英文）、中国商业联合会科技进步奖一等奖、校十佳班主任、校先进工作者、校“三育人”先进个人、校科技突出贡献奖等荣誉。指导的本科生先后进入西湖大学、加拿大阿尔伯塔大学、新加坡国立大学、英国曼彻斯特大学等国内外知名高校深造。

【第一作者简介】

廖军光，浙江青田人。2021年本科毕业于浙江理工大学生物制药专业，2024年硕士毕业于浙江理工大学生物学专业。硕士毕业后留校担任科研助理，继续从事骨生物学研究。目前聚焦骨骼细胞响应生长激素、机械应力等信号的分子机制以及颅缝闭合的细胞学策略。硕士期间，他系统解析了Nf2在颅骨与软骨发育及代谢稳态中的生物学功能，以第一作者在Nature Communications（2025）、PNAS（2026）、Bone Research（2026）、Cellular and Molecular Life Sciences（2022）等国际权威期刊发表高水平论文5篇。曾三次获一等学业奖学金，荣获2022年“奥盛”优秀学生奖学金及2024届校级优秀毕业生称号。现已录取为浙江理工大学2026级博士研究生。

【主审编辑简介】

“我们深感荣幸，本论文的主审编辑是哈佛大学医学院殿堂级科学家、美国国家科学院院士，Dr. Henry M. Kronenberg 博士，作为PTH/PTHrP-PTH1R信号通路的奠基人之一，本研究能够得到他的审阅与认可，令我们倍受鼓舞。”

Dr. Henry M. Kronenberg博士是哈佛大学医学院教授、麻省总医院内分泌科医师科学家，执掌该科长达三十余年，并于2024年当选美国国家科学院院士。他毕业于哈佛大学与哥伦比亚大学，先后在 NIH、MIT 及 MGH 完成博士后训练。他曾任美国内分泌学会、美国骨与矿物质研究学会及国际骨与矿物质研究学会的主席，这三大学术机构的最高领导职务奠定了他在骨骼内分泌领域的全球领袖地位。荣获美国内分泌学会最高奖——Fred Conrad Koch 终身成就奖、哥伦比亚大学医学研究杰出成就金奖，以及美国骨与矿物质研究学会的 Fuller Albright 青年研究者奖、William F. Neuman 奖等多项国际权威奖项。

作为骨生物学领域的先驱之一，Dr. Henry M. Kronenberg 博士是深刻定义了 PTH/PTHrP-PTH1R 信号调控网络。他率先克隆了 PTH 的 cDNA 及基因组 DNA，并与合作者共同克隆了 PTH1R 受体的 DNA，将分子生物学引入骨与矿物质研究，被誉为里程碑式突破。他首次在体内证实 PTHrP 调控生长板软骨细胞分化，并阐明了 IHH--PTHrP之间的负反馈回路，改写了软骨内骨化与骨骼生长发育的理论框架。此外，他开创性发现成骨细胞谱系通过 PTH/PTHrP 信号调控造血干细胞及其子代，首次确立骨骼作为造血微环境的关键执行者，为白血病、骨髓衰竭及移植后骨重建等研究开辟了新方向。